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阿維菌素類藥物酶聯免疫試劑盒質量標準

 本品系用阿維菌素藥物偶聯蛋白的抗原、阿維菌素類藥物多克隆抗體和酶標記羊抗兔及其它試劑制成。用于定量、定性檢測牛組織中阿維菌素類藥物的殘留量。

【物理性狀】  試劑盒外觀完整,內裝試劑齊全。包被抗原的酶聯板透明干燥且用真空包裝。阿維菌素類藥物抗體工作液、底物液、終止液、阿維菌素標準品溶液、濃縮洗滌液、濃縮復溶液為透明溶液,酶標記物為淺黃色溶液,試劑無菌檢驗均應合格。

【靈敏度測定】  取已包被好的酶標板12孔,每兩孔分別加入0µg/L、0.5µg/L、1.5µg/L、4.5µg/L、13.5µg/L、40.5µg/L標準溶液各20µL,再加入抗體工作液80µL,用蓋板膜蓋板,37℃環境中反應30min,取出用洗滌液按每孔250μL,洗板4-5次,每次浸泡10秒,用吸水紙拍干,加入100µL酶標二抗,37℃反應30 min,取出洗板5次,拍干。加入底物液各50µL,避光37℃反應15 min,用50µL終止液終止反應,置450nm波長處測定吸光度值。每一濃度標準溶液吸光度值(B)平均值除以第一個標準(0標準)吸光度值(B0)的平均值再乘以100%,即百分吸光度值。以AVM濃度(µg/L)的自然對數值為X軸,百分吸光度值為Y軸,繪制標準曲線圖。

IC50(即0濃度標準溶液的吸光度值50%處所對應的AVM濃度)范圍應在2.32µg/L ~4.57µg/L之間。

【特異性測定】  取已包被好的酶標板18孔,每兩孔分別加入0µg/L、0.5µg/L、1.5µg/L、4.5µg/L、13.5µg/L、40.5µg/L標準溶液和牛肉樣品提取液、20µg/L和50µg/L兩個濃度阿維菌素添加的牛肉樣本提取液各20µL,再加入抗體工作液80µL,37℃反應30min,取出洗板5次,拍干,加入100µL酶標二抗,37℃反應15 min,取出洗板5次,拍干。加入底物液各50µL,避光37℃反應15 min,用50µL終止液終止反應,置450nm波長處測定吸光度值。每一濃度標準溶液吸光度值(B)平均值除以第一個標準(0標準)吸光度值(B0)的平均值再乘以100%,即百分吸光度值。以AVM濃度(µg/L)的自然對數為X軸,百分吸光度為Y軸,繪制標準曲線圖。從標準曲線中查出陰性樣品和20µg/L和 50µg/L兩個濃度阿維菌素添加的組織樣品的測定濃度。

陰性樣品測定值在3µg/L以下,以20µg/kg 和50µg/kg 兩個濃度阿維菌素樣本進行添加,回收率應在60.0%~120.0%以上。

【精密度測定】  取已包被好的酶標板32孔,每兩孔分別加入0µg/L、0.5µg/L、1.5µg/L、4.5µg/L、13.5µg/L、40.5µg/L標準溶液20µL,其它20孔加入4.5µg/L的標準溶液20µL,再加入抗體工作液80µL,37℃反應30min,取出洗板5次,拍干,加入100µL酶標二抗,37℃反應30 min,取出洗板5次,拍干。加入底物液各50µL,避光37℃反應15 min,用50µL終止液終止反應,置450nm波長處測定吸光度值。

20個微孔的4.5µg/L標準溶液的光吸收值變異系數(%)應≤25%(n=20)

【適用范圍】 用于定量、定性檢測牛組織(肌肉、肝臟)中阿維菌素類藥物的殘留量。

【用法和結果判定】

1.  溶液配制

1.1  稀釋復溶液:將2X濃縮復溶液搖勻,用水以1:2比例稀釋,臨用前配制。

1.2  稀釋洗滌液:將20X濃縮洗滌液搖勻,用水以1:20比例稀釋,臨用前配制。

2.  樣品前處理

2.1  牛組織(牛肉、牛肝)樣本處理方法

2.1.1  取牛組織(肌肉、肝臟)進行均質。

2.1.2  稱取2±0.05g樣品,加入8mL乙腈,振蕩提取20min,3000g以上離心10min,取上清液5mL備用。

2.1.3  取sep-pak vac12cc(2g)柱,稱取3g無水硫酸鈉平鋪在濾板上,加入10mL乙腈溶液。 

2.1.4  加入提取液5mL,收集濾液,待提取液流干,再加入4mL乙腈清洗殘留液。

2.1.5  將收集濾液置60℃下氮氣吹干,加入1mL稀釋了的復溶液復溶。

2.1.6  取20µL進行分析。

3.  檢測步驟

3.1 將所需試劑從冷藏環境中取出,置于室溫(20~24℃)平衡30min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

3.2 取出需要數量的微孔板及框架,將不用的微孔板放入自封袋,保存于2-8℃不要冷凍。

3.3 編號:將樣品和標準品對應微孔按序編號,每個樣品和標準品均需做2孔。

3.4 用加樣器每孔加標準品或樣本20mL 后,每孔再加80mL抗體溶液。

3.5 用蓋板膜蓋板后置于37℃環境反應30min。

3.6 小心揭開蓋板膜,將孔內液體甩干,用洗滌液每孔250mL充分洗滌4~5次,每次間隔10~20s,用吸水紙拍干。

3.7 加酶標記物:每孔加入100mL。用蓋板膜蓋板后置37℃環境反應30min,取出重復洗板步驟。

3.8 顯色:每孔加入底物液A液50mL,再加底物液B液50mL,輕輕振蕩混勻37℃環境避光顯色15min。

3.9 測定:每孔加入終止液50mL,輕輕振蕩混勻,設定酶標儀于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測),測定每孔OD值。

4.  結果判定 
B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0µg/L標準溶液的平均吸光度值

以阿維菌素濃度的自然對數值為X軸,百分吸光度值為Y軸,繪制標準曲線圖。相對應每一個樣品的濃度可以從標準曲線上讀出。也可以用回歸方程法,計算出樣本溶液濃度。利用計算機專業軟件,更便于大量樣品的快速分析。

【貯藏條件和保存期】試劑盒應在2~8℃保存,保存期為6個月。

【規格】每個試劑盒含96孔板一塊;AVM標準品6瓶,1mL/瓶(0µg/L、0.5µg/L、1.5µg/L、4.5µg/L、13.5µg/L、40.5µg/L);抗體工作液1瓶,10mL;酶標記物工作液1瓶,12mL;20倍濃縮洗滌液1瓶,40mL;2倍濃縮復溶液1瓶,50mL;底物液A液1瓶,7mL;底物液B液1瓶,7mL;終止液1瓶,7mL;高濃度標準品(1µg/mL)1瓶,1mL;蓋板膜1張;自封袋1個;說明書1份;質量報告1份。

【注意事項】

1、劑盒在緩沖液配制和液體分裝上要做到無菌,防止試劑變質。

2、試劑盒標準品應經過嚴格配制后方可用于試劑盒中。

3、添加回收用的高濃度標準品需經過試劑盒自身標準驗證,合格后方可用于特異性和準確度監控用。

4、嚴格按照質量標準所述用法和結果判定內容進行試劑盒質量控制。

5、在試劑盒老化實驗中出現有不合格現象,則視該批試劑盒為不合格。

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